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脂质作为生命体的基本构成组分发挥着重要生理功能。脂质的异常分布是动脉粥样硬化、脂肪肝、糖尿病等多种疾病的重要病理特征，例如动脉粥样硬化是一种以动脉脂质异常沉积为特征的常见疾病，而针对动脉粥样斑块的高空间分辨荧光成像对于其病理研究具有重要价值。
近日，香港科技大学、华南理工大学唐本忠院士团队与医院郑磊教授，合作报道了一种能够在脂相及水相通过单一波长激发同时发出双色荧光的聚集诱导发光（AIE）探针（图1），可特异性结合至动脉粥样斑块，通过高分辨双色荧光成像有效揭示其微观病理结构。
图1单一波长激发双色荧光成像示意图。
作者首先通过简单的Knoevenagel缩合反应制备了荧光分子IND，该分子在THF溶液中的最大发射波长为nm，但在水含量为99%的THF和水的混合溶液中，最大发射波长红移至nm且强度明显增加（图2a-d）。通过单晶结构分析发现，相邻的两个IND分子呈反向平行排列，通过π?π相互作用（3.?）
形成了“二聚体”（图2e-f），进一步通过C?H?O相互作用将“二聚体”连接在一起。该“面对面”的二聚体排列方式，表明IND分子通过形成激基缔合物（excimer）导致聚集态的发光明显红移，同时由于聚集态的分子内运动受限，导致荧光明显增强。
图2具有AIE性质的IND分子的合成路线、吸收和发射光谱以及晶体堆积结构。
作者进一步考察了IND分子在脂相和水相中的发光行为。如图3所示，在葵花籽油和水的混合物中，UV灯照射下，IND分子在上层的脂相发出明亮的绿色荧光，而在下层水相发出明亮的红色荧光，两者的最大发射波长相差nm，表明IND分子可在单一波长激发下，在脂相和水相中发出双色荧光。这是由于IND分子在脂相中以单分子形式存在，而在水相中以“dimer”形式聚集。
图3.IND分子在脂相和水相中的双色荧光及分散方式示意图。
作者进一步利用IND分子染色泡沫细胞（一种常见于动脉粥样硬化斑块中富含脂滴的特征性病理细胞），并与传统脂滴染料油红O的信号进行对比，发现IND分子的荧光信号与油红O的信号分布高度一致，表明IND分子可以特异性染色细胞内的富含脂类分子的脂滴（图4a）。另外，作者通过双光子激发（nm）的高分辨率荧光成像，发现泡沫细胞内的脂滴含量与氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）的孵育浓度呈明显地正相关，并通过流式细胞分析进行了证实（图4b-d）。
图4.IND分子特异性染色泡沫细胞中的脂滴。
作者进一步考察了IND分子对动脉粥样硬化斑块的特异性成像能力。基于脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)的小鼠，构建了动脉粥样硬化的动物模型，进一步将分离得到的主动脉通过IND分子染色1分钟后，在UV灯照射下，发现动脉粥状斑块的富含脂质区域发出明亮的绿色荧光，且与日光下血管内壁上白色沉积区域一致（图5a）。进一步通过组织切片的HE染色证实了绿色荧光区域为动脉粥样斑块区域，表明IND可特异性染色动脉粥样斑块。作者进一步通过双光子荧光显微镜观察了动脉粥样斑块的精细结构，在nm激光照射下可逐层观察斑块中不同深度且大小不等的脂质区，最高深度可达μm（图5b-c）。另外，在动脉粥状斑块周围观察到呈纵向波浪形平行排列的条纹结构并发出绿色荧光，结合动脉组织学分析，作者推测该绿色条纹为动脉收缩导致的轻微隆起的微脂纹区。有趣的是，在绿色微脂纹条带间可观察到细小晶体构成的红色条状荧光，与微脂纹区间隔平行排列，这可能是由于IND分子在动脉内层微皱褶内的水相中析出红色荧光晶体所致（图5d-e）。以上结果表明IND分子可在单一波长的双光子激发下同时实现脂质区（绿色）/微皱褶区（红色）的高分辨双色荧光成像，有助于无损、原位、立体分析微观动脉粥样斑块结构，克服了传统化学染料需逐层切片染色且操作复杂的缺陷，并拥有传统染料无可比拟的高空间分辨率的优势。
图5.针对ApoE基因敲除小鼠模型的主动脉粥样斑块的双色荧光成像。
在本研究中，作者构建了一种具有AIE性质的新型荧光探针IND，具有单一波长激发双色荧光成像的重要优势。IND分子可在脂质中以单分子形式存在并发出明亮的绿色荧光，在水相中以“dimer”形式聚集并发出明亮的红色荧光。这些独特的性质使得IND分子可同时实现动脉粥样斑块的脂质区和微褶皱区的深层、双色高分辨荧光成像，有助于动脉粥样斑块的病理研究。该成果近期发表在MaterialsHorizons上，文章第一作者为医院司徒博博士、华南理工大学的高蒙副研究员以及南方医科大学硕士生何晓静，通讯作者为唐本忠院士和郑磊教授。
文章作者：BoSitu,MengGao,XiaojingHe,ShiwuLi,BairongHe,FengxiaGuo,ChunminKang,ShanLiu,LeiYang,MeijuanJiang,YanweiHu,BenZhongTang*,andLeiZheng*
文章题目：ATwo-PhotonAIEgenforSimultaneousDual-ColorImagingofAtheroscleroticPlaques
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